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            β-木糖苷酶測定試劑盒 微量法

測定意義：β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細(xì)菌和真菌等生物體，是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guān)鍵酶，產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵。另外，β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應(yīng)用于造紙工業(yè)，比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

測定原理：β-木糖苷酶催化對硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對硝基苯酚，對硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰，測定405nm光吸收增加速率，可計(jì)算β-木糖苷酶活性。

需要的儀器，耗材:天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。 

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一、粗酶液提?。?1. 植物樣本：稱取約 0.1g 樣品，加 1mL 提取液充分冰浴勻漿，然后 12000rpm，4℃，離心 20min，棄沉淀 ，取 20μL 上清測定蛋白含量，剩余上清作為待測酶液。 2. 細(xì)菌、真菌樣本：收集約 500 萬個(gè)細(xì)胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎（冰浴，功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000rpm，4℃，離心 10min，棄沉淀 ，取 20μL 上清測定蛋白含量，剩余上清置于冰上待測。 3. 標(biāo)準(zhǔn)液的處理：用試劑二將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0μmol/ml。二、測定操作表： 1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長 405nm，對照管調(diào)零。 2、操作表對照管 測定管 標(biāo)準(zhǔn)管酶液（μL） 40 40 40 試劑一（μL） 10 試劑二（μL） 80 70 80 混勻，45℃水浴 20min 試劑三（μL） 80 80 80 混勻，靜置 5min，對照管調(diào)零， 微量石英比色皿/96 孔板，測定 405nm 吸光值，記為 A405。

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β-木糖苷酶活性計(jì)算公式：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度（x）和濃度（y，μmol/ml）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將△A帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算 樣品生成的產(chǎn)物量（μmol/ml）。 1、按蛋白含量計(jì)算酶活定義：45℃，pH7.4 時(shí)，每毫克蛋白質(zhì) 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 mol 對硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。 β-木糖苷酶活性（μmol/min / mg prot）=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=0.25×y÷Cpr 2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：酶活定義：45℃，pH7.4 時(shí)，每克樣品 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 mol 對硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。 β-木糖苷酶活性（μmol/min /g）＝(y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=0.25×y ÷W 3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：酶活定義：45℃，pH7.4 時(shí)，每 10 4個(gè)細(xì)胞 1min 內(nèi)催化產(chǎn)生 1 mol 對硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。 β-木糖苷酶活性（μmol/min /10 4cell）= (y×V 反總)÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.0005×y Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500 萬；T：反應(yīng)時(shí)間，20min。